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造血幹細胞移植之現在與未來 林口長庚紀念醫院臨床病理科 陳定平、孫建峰 【Abstract】 |
| 中文摘要 壹、序 2003年美國骨髓移植學會在科羅拉多州的丹佛舉行一年一度的醫學研討會，議程從一月三十日至二月三日連續五天，會議內容包含下列九大主題： 1. Immunogenetics of Blood and Marrow Transplantation； 2. Histocompatibility/Alternative Stem Cell Sources, Graft Processing； 3. Autologous SCT, Soloid Tumors； 4. Allogeneic SCT, GVH/GVL； 5. Reconstructing Immunity Following Allogeneic Transplantation； 6. Management of Bone Marrow Failue Patient； 7. Reducing Morbidity and Mortality after Allogeneic SCT； 8. Biology of GVHD； 9. Impact of CMV in Stem Cell Transplantation 會議內容整體而言，深入淺出，可說是廣度及深度皆具之專題研討會，使吾人對造血幹細胞移植有更正確及更新穎的瞭解，茲就造血幹細胞移植最新的醫學知識及可引進國內之技術分述如下。 貳、造血幹細胞移植簡介 骨髓移植及造血幹細胞移植皆是以自體或異體造血幹細胞輸入患者體內，以達到輸注幹細胞進行免疫治療及支持病患接受高劑量放射或化學治療之目的。 所謂造血幹細胞乃是存在於骨髓內的多能幹細胞(pluripotent stem cells)，它能自我更新、成熟分化成任何一種系列血球細胞，包括紅血球、單核球、顆粒球、淋巴球以及血小板。過去絕大部份移植的幹細胞來源是骨髓，因此骨髓移植就被慣用至今。近年來研究發現骨髓經過適當的刺激，會將大部分的造血幹細胞釋放到周邊血液中，且周邊血液幹細胞移植不用進手術室取骨髓，且成功植入所需時間短，臨床上應用漸增，已有後來居上之勢，目前大部份的造血幹細胞移植皆是採用周邊血液幹細胞移植。 ㄧ、移植種類 一般移植名詞的分類，我們可以根據捐髓者與受贈者之關係分為同系(syngeneic)移植或、異體(allogeneic，或稱為同種) 移植、以及自體 (autogeneic) 移植等三類，同系指的是同卵雙胞胎之間的細胞或器官的移植，異體指的是同種之間的移植，而自體移植顧名思義即是病人自己本身來源預先貯存細胞的再移植。而在討論造血幹細胞的來源時，我們加以區分成骨髓、周邊血液、及臍帶血等。 骨髓是血球及淋巴球製造的地方，因此骨髓作為造血幹細胞的來源是天經地義的。人類骨髓移植在近30年的努力終於發展在臨床治療使用之上，包括血液學的惡性疾病(血癌、淋巴癌等)、骨髓造血不良症候群(先天或後天再生不良性貧血等)、血色素病變(如重型海洋型貧血等)、先天性免疫缺乏症候群、先天代謝性疾病(如Gaucher高雪貯積疾病)、及應用於癌症高劑量化療之用。 周邊血液造血幹細胞移植則是最近才開始的醫療行為，早在1980年代就發現病人化療之後由白血球貧乏期恢復時周邊血液會有較多量的造血幹細胞存在，此ㄧ事實便可利用來作收集周邊血液造血幹細胞之用，通常會伴隨使用recombinant growth factor 如G-CSF去刺激骨髓造血；而正常人也可以經由G-CSF之刺激造血並釋放造血幹細胞到周邊血液之中。病人輸注此種周邊血液造血幹細胞後周邊血球值恢復的預期時間會比骨髓來源快，再加上周邊血液獲得幹細胞的方法要比骨髓容易，且不必作麻醉，因此現在絕大數的幹細胞來源是周邊血液。 至於臍帶血幹細胞基本上要比骨髓中的幹細胞純真(Naïve)，其免疫活性要比骨髓或周邊血液中的幹細胞低。據研究臍帶血中有核細胞含幹細胞的比率較高，所含幹細胞也多屬較早期的幹細胞，因此輸用到人體後能成功移植到骨髓微環境的比率也較高(10倍有效性)。雖然臍帶血幹細胞移植的病人，其骨髓抑制(myelosuppression)期稍長，但各種感染理論上會減少，另外附帶的不良反應如移植物反宿主疾病(graft versus host disease, GVHD)相對也較少。 不過，臍帶血所獲得的造血幹細胞劑量低，只能應用在體型小或體重輕的小孩身上。 二、移植原理 移植病患在移植前給予高劑量放射/化學治療，這在治療上有兩層意義：一是達成消滅腫瘤細胞；二是清除患者體內之造血及免疫系統(myelo- ablation & immunosuppresion)，使幹細胞能順利植入，這在異體幹細胞移植中扮演極重要的角色。移植病患在經過高劑量化學或放射治療後，通常造血及免疫系統已受到極強之抑制及摧毀，此時輸予造血幹細胞，能使受損之造血系統及時恢復。後來又發現在異體移植時異體的幹細胞可能會具有移植物抗血癌細胞作用(graft versus leukemia reaction, GVL)，達到消滅腫瘤細胞的效果。 三、找合適之捐贈者 異體移植時為了避免移植排斥(graft rejection)，必須選用人類白血球抗原系統（human leukocyte antigen, HLA）配合度良好的造血幹細胞才做移植，但即使移植時選用HLA完全相同的造血幹細胞，排斥作用仍然存在，而移植物抗宿主反應(graft versus host reaction)也經常發生，表示我們體內認識自我與非自我的抗原並非單由HLA抗原來決定。相對的，由於此種免疫的存在，移植進去的淋巴細胞也會有移植物抗血癌細胞的效應存在。至於GVHD會造成移植不良反應，在過去親屬間之移植成效要比非親屬間之異體移植成效好很多。不過，近年來由於治療上及HLA分型進步許多，親屬與非親屬間之成效已相差不多。在自體移植方面，由於並無排斥或GVHD等方面困擾，但是缺乏移植物抗血癌細胞的作用，不能把殘存的血癌細胞繼續去除，病人比較有疾病復發的疑慮；另外，除了殘餘的惡細胞存活下來可能造成復發之外，也有可能是因為自體移植時夾雜在病人收集的幹細胞中，隨著自體移植時重新輸回給病人所造成。 總之，移植前必須先找到合適的捐贈者，目前造血幹細胞移植要求捐贈者與受贈者的主要組織相容性愎合體（major histocompatibility complex, MHC）相同才行捐贈。它的基因位在第六對染色體的短臂上(21p)，具高度多型性變異(polymorphism)，不同個體間的差異性極大，產生的蛋白位於細胞表面，負責抗體加工及辨識敵我。因此，人體的後天性免疫藉由HLA系統來區分自體與外來抗原(如：病毒、細菌等)。基於上述原因，HLA分型相同與否決定器官或骨髓移植的成功率，HLA分型相似性愈高，移植物反宿主疾病的併發症發生率愈低。所以骨髓移植時要求捐贈者與受贈者之HLA-A、B、C及DR必須完全相同。 目前測定HLA的方法逐漸以分子生物測定法為主，利用polymerase chain reaction (PCR)放大HLA基因。根據分析的解析度又可將之分為Low-及High-resolution method(即direct sequencing)。Low-resolution method可初步分型HLA系統；High- resolution method除可高度分析HLA基因上各alleles的差異外，也可提高異體移植的成功率。林口長庚醫院目前主要採用PCR-SSP (sequence specific primer)法偵測HLA-DR specific alleles的存在與否，其原理為加入sequence- specific primers及internal control primer (確保PCR反應的正確性)，專一性地複製不同HLA alleles的DNA fragments，再透過電泳比對DNA的大小，藉以推斷出各專一性的HLA alleles。 四、幹細胞收集及計算 自體骨髓移植的病人在移植前恢復時期，先將週邊血液幹細胞抽出來，等病人做好骨髓抑制後，再輸注至病人體內。至於異體骨髓移植的病患，於第一次移植時，即收集過量的捐贈者週邊血液幹細胞，剩餘的幹細胞予以冷凍，於病人復發時可做第二次移植。根據最新研究結果顯示，異體骨髓移植的病患，每公斤體重輸注5 x 106顆幹細胞是最適宜的移植濃度。過量的幹細胞相對T細胞也多，移植物抗宿主疾病隨之增加；若太少則易復發，使移植物抗血癌細胞效應下降。 計算方面可利用CD34，它是一種115KD的糖蛋白，所有的祖細胞都包含此種抗原，因此測定骨髓或周邊血液細胞中包含CD34抗原的細胞含量，可間接評估所收集的BM or PBSC中是否有足夠的幹細胞供移植用。至於如何計算包含CD34抗原的細胞含量，可以利用流式細胞儀(flowcytometry)的方法，其原理是先將已結合上螢光染料的單株抗體與白血球之標的物(CD34 epitope)作用後，再將這些已染上螢光染料之細胞通過流動水流，並以雷射光(波長488nm 的氬離子雷射)照射，接著以適當的濾片去篩選過濾所欲測定的波長，最後使用光子偵測器(photodetectors )將訊號接收放大後，再轉換處理成數據並儲存起來，待測定完後再予以分析 另一方面，分析骨髓及周邊血液幹細胞中granulocyte/macrophage progenitor cells之生長情形和菌落數目，才能真正客觀評估骨髓及周邊血液中幹細胞在病人體內的生長狀態。換言之，在Ultra-CSF與3﹪agar medium中，藉由培養觀察分化細胞(differentiated cells)之生長情形和菌落數目，可以鑑別定量granulocyte/macrophage progenitor cells。其中3﹪agar medium中所含的小牛胎兒血清(fetal bovine serum, FBS)為細胞培養液中提供細胞生長所需之養分，使用前必須先去補體活性，以避免因補體作用造成細胞死亡。 五、移植後追蹤 目前可以短片段重複序列(short tandem repeats, STR)執行造血幹細胞移植後追蹤。所謂短片段重複序列是在研究人類基因組之連續圖時發現的，屬於頭尾相接之重覆DNA序列內的微衛星(microsatellites)，其重覆單元序列僅2~7個鹽基，大多以2個、3個、4個鹽基為一單位，不斷重覆延伸至數百個鹽基對，由於這些重覆單元長度都很小，故又稱為短重覆序列(short tandem repeats)，簡稱STR。首先找出捐贈者與受贈者間不同的STR alleles，若移植成功，受贈者之STR alleles應與捐贈者完全相同，若出現任何受贈者移植前之STR allele，則病人可能發生復發，故STR可用於監測骨髓移植。臨床上通常在移植後的第一、二、三及六個月追蹤一次，之後則是每年追蹤一次。 移植後復發通常表示植入之造血幹細胞遭受宿主殘存之免疫系統攻擊，使造血系統無法建立完全。事實上植入失敗是非常嚴重的併發症，此時患者舊有造血系統已遭摧毀，新造血系統又無法建立，唯有二次移植才能挽救患者生命。 六、移植體抗宿主疾病(GVHD)之預防及治療 因輸入之幹細胞混雜淋巴細胞攻擊宿主，發生時間約在移植後兩週至三個月內。GVHD通常會侵犯三個器官：腸胃道（嚴重腹瀉）、膽道（黃疸）及皮膚（紅疹及脫屑）。預防方法為移植前後給予免疫抑制劑cyclosporine，若仍發生GVHD則給予高劑量類固醇治療。然而免疫抑制劑的使用必須仔細斟酌，因為「移植物反宿主疾病」與「移植物抗白血病及腫瘤效應」是一體的兩面，使用過強的免疫抑制劑可能使移植體抗白血病及腫瘤效應下降而增加疾病復發的機會，但不使用免疫抑制劑，移植體抗宿主疾病又會有致命的危險。 參、可引進之新觀念及新技術 1.非根除性造血幹細胞移植 (Non-myeloablative transplantation) 骨髓移植的最大限制在於因毒性過大，不能使用於老年病患。非根除性造血幹細胞移植旨在減低移植前的治療強度，使全血球低下的時間縮短而減低移植的危險。此外非根除性造血幹細胞移植還可造成特殊之混合雜交(mixed chimerism)狀態，即受髓者體內同時存在捐髓者及受髓者之造血細胞，藉由這巧妙之免疫平衡而發揮抗腫瘤效果。 2.臍帶血移植(Cord blood transplantation)之推廣 臍帶血因取得過程不具傷害性，且不需人類組織抗原完全相符，可容忍1/3不符，因此是極具潛力之幹細胞來源。缺點是細胞數目少，目前多半用於兒童以及體型較小之成人。目前世界上多家生物科技公司正積極開發突破此缺點，相信不久的將來可廣泛應用於全人類。 3.T細胞去除術(T cell depletion) T細胞去除術是降低移植物抗宿主疾病最有效的預防方法，但相對的會使免疫的移植物抗腫瘤(graft versus tumor, GVT)效應喪失。最新研究顯示外來T細胞引發GVHD必須經由CD marker傳遞移植物抗宿主訊息，其中CD28及CD125扮演關鍵的角色，故臨床上可應用Anti-CD28及Anti-CD125 antibody阻斷移植物抗宿主訊息以降低GVHD發生率。 4.兩次輸注法 (Stem cell infusion, then CD4+CD25+ cell infusion) 提高移植成功率 如前所述促進造血幹細胞移植成效之兩大因素分別為降低移植物抗宿主疾病及提升移植物抗血癌細胞效應，長久以來兩者的關係就像天平的兩側，無法同時兼顧。當執行T細胞去除術降低GVHD，則GVL效應變差；反之，當T細胞保留時GVL效應上升，但相對GVHD也隨之變嚴重。新的研究顯示，若我們將所需的造血幹細胞分兩次輸注，第一次不須做T細胞去除術直接輸注至病人身上，可保留移植物抗血癌細胞效應；第二次輸注經挑選的CD4+CD25+造血幹細胞，經過一連串微妙的細胞免疫變化，能明顯降低GVHD。（目前推測是因為造成GVHD最大的因素是CD8+ T cells，若輸注經挑選的CD4+CD25+造血幹細胞，可降低GVHD的發生率） 5.腫瘤細胞去除術(Tumor cell depletion) 自體造血幹細胞移植最大的問題就是祖細胞製品受到潛在的癌細胞污染，為降低此潛在危險性，可以行腫瘤細胞去除術。其原理為利用腫瘤細胞表面獨特的抗原標誌，再利用對抗此抗原之專一性抗體與之交互作用，而此抗體上帶有磁珠(magnetic beads)，當通過一條具有磁性的管子後，腫瘤細胞就會被吸附在管壁上，進而達到去除腫瘤細胞的效果。 肆、結語 早期的骨髓移植在近十年已漸漸被周邊血液幹細胞移植所取代，其優點是移植病患恢復期短，捐贈者所受的物理性傷害較小，然而GVHD的發生率仍是居高不下。針對此缺點，臍帶血正好能降低GVHD發生率，等臍帶血幹細胞能成功地在體外大量培養而不失其分化分裂之功能時，臍帶血移植將可成為未來造血幹細胞移植之主流；除此之外，臍帶血中的幹細胞亦有它種醫療用途，如應用臍帶血幹細胞治療器官缺陷，甚至操控幹細胞發育成治療上所需之器官或組織。過去的研究認為幹細胞註定要發育成一定的器官，例如大腦幹細胞發育成大腦，心臟幹細胞發育成心臟。但新的研究發現幹細胞可在研究人員操縱下，利用基因轉殖技術及細胞激素(cytokines)之協同作用發育成特定的組織或器官。相信不久的將來，幹細胞將在下一波的醫療科技上大放異彩。 |
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