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台灣醫檢雜誌 - ALL ISSUES



台灣醫檢會報第18卷第2期 Bulletin of Taiwan Society of Laboratory Medicine Vol.18 No.2, 2003

綜說 

細胞死亡

中山醫學大學1免疫學研究所2醫技系 黃啟瑞1 楊繼江

【Abstract】
中文摘要
細胞死亡是指細胞受到損傷且影響到細胞核時,細胞會呈現代謝停止、結構破壞和功能喪失等不可逆變化的現象。
對於細胞的死亡形式,在1995年,Guido Majno和Isabella Joris將一些值得注意的細胞死亡名稱列出來,這些名稱包括:細胞壞死(Necrosis)、凝固性壞死(Coagulation necrosis)、自溶(Autolysis)、生理性細胞死亡(Physiological cell death)、程序性細胞死亡(Programmed cell death)、染色質裂解(Chromatolysis)、核碎裂(Karyorhexis)、核溶解(Karyolysis)、細胞自殺(Cell suicide)(包含三種型式:溶酶體引起的(By lysosome)、自由基引起的(By free radical)和基因機制引起的(By a genetic mechanism,這被認為是細胞凋亡Apoptosis))。也認為非經由細胞凋亡而死亡的細胞,其死亡現象應稱為由Bessis所提出的「偶發性細胞死亡(Accidental cell death)」,不應該稱為細胞壞死,因為細胞壞死不是一種細胞死亡的形式,而是一種經由任何機制(包括了細胞凋亡)所引起的細胞變化[1]。
缺血性細胞死亡(Ischemic cell death)是目前已知偶發性細胞死亡的代表,通常會伴隨著細胞腫脹的現象,Guido Majno和Isabella Joris認為這樣的現象應該被稱為「腫脹性壞死(Oncosis)」;也有人認為這樣的現象可用來指凝固性壞死(Coagulation necrosis)[2];而這個專有名詞最早是由von Recklinghausen在1910年所提出的。“Oncosis”這個字是源自“Ónkos”,為腫脹、腫大的意思。而細胞之所以會有腫脹的現象,是因為細胞在缺乏ATP的幫助下,致使離子幫浦(Ion pump)失調的緣故。因此Guido Majno和Isabella Joris認為「腫脹性壞死」和「細胞凋亡」是兩個相對的現象(圖一),因為腫脹性壞死會有大水泡(Blebbing)與引發發炎反應,而細胞凋亡則有水泡出芽(Budding)現象1。
因此,Guido Majno和Isabella Joris認為用來說明細胞死亡的形式有兩個:一個是經由外物而造成的死亡,也就是偶發性細胞死亡;另一個,就是細胞經由自殺的手段所造成的死亡,也就是細胞凋亡。
其實早在150年前,細胞病理學的先驅者Rudolph Virchow (1902-1982)就觀察到細胞死亡的方式有兩種,一是「細胞壞死 (Necrosis)」,一是「細胞漸進性壞死 (Necrobiosis)」。前一種的細胞死亡方式,其細胞就像當場遺體解剖一般,「開腸破肚」地攤在原地;但後一種的細胞死亡方式,其細胞到最後就會則是慢慢地消失,也有人將之稱呼生理上的細胞死亡(Physiological cell death)[3]。「生理上的細胞死亡」這個詞首先是由Walther Flemming2在1885年所提出。當初Vichow對細胞壞死所下的定義,是指組織在組織破壞的發展時期,其定義較相似於現在在病理學上所稱的壞疽(Gangrene)。另外,「細胞漸進性壞死 (Necrobiosis)」這個詞最早是由K. H. Schultz提出,而Vichow將其引用來說明其所觀察到的細胞死亡方式。其實「細胞漸進性壞死」這個詞,當初的定義是指“組織裡有某一部份消失了,以致於無法察覺其之前的組織形態為何,而在其死亡過程終點,也沒有任何的壞死細胞片段產生3”。稍後,Vichow更為「細胞漸進性壞死」下了一個廣義的定義:細胞漸進性壞死是一種在生物體內屬於自發性的細胞死亡,其破壞和廢止細胞功能都是自然存在的,可用來對抗嚴重的死亡(壞疽)4。因此,細胞漸進性壞死通常用在說明“緩慢地死亡過程”或“活體裡組織的死亡”現象[1]。
因此,從這麼多的資料說明可以知道一些事實,就是:壞死是任何細胞死亡到最後必定進行、也是唯一相同的一個結果,而細胞死亡的過程只是一種致死細胞方式的表現。而這麼多的細胞死亡的名稱,其實可被簡單歸納成兩種致死細胞方式:一種是自殺(Death by suicide),另一種是他殺(Death by murder)。
圖一. 「腫脹性壞死」和「細胞凋亡」。最上面的細胞是正常細胞。1A:細胞腫脹;1B:細胞發生壞死,染色質不規則聚集,因細胞膜通透性增加導致細胞腫脹,進而使得細胞膜破裂及形成大水泡;1C:細胞壞死變化,細胞膜破碎,但仍保持原細胞輪廓;2A:細胞凋亡早期:細胞皺縮和細胞核濃縮;2B:細胞的水泡出芽和細胞核碎裂;2C:細胞凋亡晚期:細胞核斷裂成碎片,細胞核膜將其圍繞、分隔,產生凋亡小體。
細胞壞死(Necrosis)與非細胞凋亡造成的細胞壞死(Non-apoptotic necrosis)
細胞壞死通常是指組織內的局部細胞死亡的情況;而這樣的死亡細胞大多會引起發炎反應。事實上,細胞死亡和細胞壞死兩者的定義是不同的,也就是說細胞死亡是一種導致細胞無法回復的過程;而細胞壞死是指細胞死亡後一連串變化的過程。所以,細胞壞死是指“細胞都已經完全死亡後所進行的過程”;而細胞死亡是指“從細胞進入無法回復的死亡之點到完全死亡的過程”。這樣的區別可從這兩者的發生時間起點來判斷。
其實細胞壞死這個詞已經被使用了約二千年了,一直都是用來指組織遭到破壞且嚴重到用肉眼就可見,因此更可知道細胞死亡和細胞壞死是指不同的事件,而我們一般所稱的細胞壞死,大多強調細胞不是經由細胞凋亡所造成的死亡。通常在細胞死亡後幾個小時才可見細胞形態上的變化,也就是細胞壞死,這些變化包括了細胞核和細胞質的變化:在細胞核中,一開始會有核濃縮(Pyknosis)5,接著會有核碎裂(Karyorhexis),最後會有核溶解(Karyolysis)6的現象;在細胞質中,可發現結構鬆散和片段化的現象[1]。在顯微鏡下觀察,可發現其死亡的細胞是一群的,和細胞凋亡細胞死亡是個別地,其現象有所不同。另外,當細胞壞死開始進行時,細胞內有些酶的活性會降低,例如:琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase)等;另外,壞死的細胞其細胞通透性也會增加。
而細胞壞死的基本類型,可分為:凝固性壞死、液化性壞死、纖維素樣壞死與壞疽。
凝固性壞死(Coagulative necrosis)是指壞死細胞的蛋白質凝固所產生的情況,而這樣的壞死細胞通常還可見其細胞輪廓,這可能是由於局部組織酸中毒使壞死細胞的結構蛋白和酶蛋白變性,封閉了蛋白的溶解過程。這樣的壞死現象大約是在1877年左右被Carl Weigert和Julius Cohnheim發現。而乾酪性壞死(Caseous necrosis)是指徹底的凝固性壞死,為結核病的特徵性病變,若用肉眼觀察的話,可在組織中發現有呈現白色或微黃、細膩,形似奶酪的壞死區域。但在顯微鏡下看不見原有組織結構的殘留,甚至看不見核碎屑。
液化性壞死(Liquefactive necrosis)是指壞死的組織會因酵素分解而成液化的現象。這樣的壞死現象最常發生於含可凝固的蛋白少和脂質多的組織;因此,像一些經化膿、脂肪壞死和細胞水腫發展而來的溶解性壞死(Lytic necrosis)都是屬於液化性壞死。在脂肪壞死(Fat necrosis)中又可分為創傷性和酶解性兩大類。創傷性的脂肪壞死好發在皮下脂肪組織,致使脂肪細胞破裂,脂肪外溢,引起巨噬細胞吞噬脂肪反應,形成局部種塊;酶解性的脂肪壞死常見於急性胰臟炎,與胰脂酶外溢消化胰臟周圍的脂肪組織有關。脂肪壞死時,會有大量的脂肪酸形成常繼發營養不良性鈣化(鈣皂形成),且會留下模糊混濁的輪廓,用肉眼看的話,可發現其組織會呈現白色的斑點或斑塊。
纖維素樣壞死(Fibrinoid necrosis)多發生在結締組織和血管壁,是屬於一種變態反應性結締組織疾病(風濕病、類風濕性關節炎、系統性紅斑性狼瘡、節結性多動脈炎等)和急進性高血壓的特徵性病變。在顯微鏡下,壞死組織呈細絲、顆粒狀紅染的纖維素(纖維蛋白)樣,聚集成片塊狀。纖維素樣壞死物質可能是腫脹、崩解的膠原纖維(由於抗原-抗體複合物所引發),或是沉積於結締組織中的免疫球蛋白,也可能是由血液中滲出的纖維蛋白原轉變成的纖維素。
壞疽(Gangrene)也是細胞壞死的一種,主要是因有腐敗菌在身體直接或間接地與外界大氣相通部位生長,發生繼發腐敗的現象,使得這些部位有較大範圍的壞死;其類型可分為乾性、濕性和氣性三種。乾性壞疽(Dry gangrene)常繼發於肢體,水分容易蒸發的體表組織壞死,由於壞死組織乾燥,腐敗菌感染一般較輕,邊界清楚。濕性壞疽(Moist gangrene)常繼發在腸管、膽囊、子宮、肺等與外界溝通,但水分不易蒸發的臟器壞死,也苦繼發在動脈受阻同時有靜脈淤血的體表組織壞死,由於壞死組織含水分較多,腐敗菌感染嚴重。一般而乾性和濕性壞疽多繼發在動脈阻塞引起的缺血性壞死(梗死)。氣性壞疽(Gas gangrene)通常其邊界不太清楚,其常繼發在深層的開放性創傷,通常會合併厭氧產氣莢膜桿菌感染,這些細菌在分解壞死組織時會產生大量氣體,使壞死組織內含有氣泡且呈蜂窩狀;另外,氣性壞疽也時也會有伴隨發生全身性中毒的現象。
細胞在進行細胞壞死後,通常會產生一些現象:細胞壞死後會發生自溶的現象,並在壞死局部引發急性炎症反應;壞死組織溶解,經由淋巴管、血管吸收,或被巨噬細胞吞噬清除;壞死的組織會有分離、排出,形成缺損;產生機化、包裹現象;壞死組織可繼發營養不良性鈣化。然而,當組織細胞一旦進行了細胞壞死的過程,其是否對個體有影響,仍要取決於:壞死細胞的重要性、壞死細胞的數量、壞死細胞所在器官的再生能力和發生壞死器官的儲備代償能力。
細胞壞死大多發生在病理的情況下,而進行細胞壞死的細胞大多會有一些特徵,包括:細胞會腫脹、細胞會脹破。另外,也有一種情況稱為前細胞壞死階段(Prenecrosis phase),在此時,細胞內的內質網(Endoplasmic reticulum)會呈現脹大的現象、粒線體也會呈現腫脹的情況,然而這是屬於可回復的現象。而無法回復的細胞壞死現象是會有細胞粒線體不正常的腫脹,且通常會伴隨粒線體結構的瓦解[4]。
細胞凋亡(Apoptosis)與細胞凋亡所造成的細胞壞死(Apoptotic necrosis)
有科學家認為細胞凋亡包括了細胞死亡和細胞壞死兩種情況:前一種是細胞死亡的進行方式,後一種是指細胞死亡後所進行的過程,而這樣的過程被稱為細胞凋亡性細胞壞死(Apoptotic necrosis)[1]。關於細胞凋亡其實早在1914年時已有科學家發現此情況的產生,當時將此現象稱之為「染色質溶解 (Chromatolysis)7」,因此科學家們認為這個詞是最早用來形容細胞凋亡的專有名詞[1]。而後澳大利亞(Australia)的科學家J. F. R. Kerr也發現到此現象且深入地進行研究[3]。在1965年,J. F. R. Kerr發現老鼠肝臟在非致命的缺血情況下,肝臟細胞會產生有逐漸萎縮的現象,甚至有些細胞還會恢復成正常。這種不同當時所稱的細胞壞死(Necrosis)的細胞死亡現象,J. F. R. Kerr就根據其形態上的變化,將之稱為「皺縮性的細胞壞死 (Shrinkage necrosis) 」[5]。之後,J. F. R. Kerr就在亞伯丁大學 (University of Aberdeen) 希臘文教授James Cormack的建議下,在1972年 正式將「皺縮性的細胞壞死」這詞更改為「細胞凋亡 (Apoptosis) 」[3]。而“Apoptosis”這個詞是來自希臘文,原意是指花瓣從花朵掉落或指樹葉從樹上飄落。其中“apo”的意思是指「離開」,強調「分離、分開」的意思;而“ptosis”的字根意義是指「落下」意思,而其也有閉上眼的意思[3, 6]。
「細胞凋亡」這個詞在1970年代是和「細胞分裂 (Mitosis) 」並列為調節細胞族群的兩個機制。雖然細胞凋亡是控制著細胞去除的機制,但相對於細胞分裂而言,並不是扮演著一個對抗的角色,而是一個互補的角色[3],並且也認為細胞凋亡在正常細胞、前腫瘤細胞(Preneoplastic cells)和腫瘤細胞(Neoplastic cells)的去除是重要的調節者。另外。細胞凋亡在健康的個體中也扮演著正常細胞的更新、在正常的胚胎發育上也扮演著剔除局部不需要的細胞等角色。在早期,Kerr等人發現細胞在進行細胞凋亡的過程中,以電子顯微鏡觀察其結構上的變化,發現可將之區分為兩個主要的時期;第一個時期包括:細胞核及細胞質的濃縮、細胞會崩解成一大群被細胞膜包裹好好的碎片,而這些碎片也就是凋亡小體(Apoptotic bodies),所以在這時期最主要的特徵,就是凋亡小體的形成;第二個時期:這些凋亡小體會從上皮細胞表面消失,或被其它的細胞分解、消化,而這樣的一連串的分解、消化現象,相似於物質在吞噬體(Phagosomes)中自溶(Autolysis)現象,因此在此時期,最主要的現象就是凋亡小體的被吞噬的情況。而凋亡小體這個名稱的由來,是因為Kerr等人在觀察凋亡細胞的組織切片時,會有被細胞膜包覆著細胞核碎片的圓形碎塊出現,類似於因急性黃熱病在肝細胞所引起的康錫曼氏小體(Councilman bodies),且因為發生在凋亡的細胞上,故而稱之。而凋亡小體的形成和一些現象有關:細胞核和細胞膜會有顯著性地濃縮、細胞核會形成碎片狀和在細胞表面會有結節狀出現,這些現象都是凋亡小體形成之前,細胞所產生的現象,而這些凋亡小體的大小也沒有一定的規則。
相對於細胞壞死而言,細胞凋亡通常是指一個細胞的死亡情況,細胞凋亡的細胞會和相鄰的細胞逐漸脫離,且會有細胞濃縮和片段化的現象;細胞內的胞器會緊湊的聚在一起,但粒線體仍是呈現正常的情況[4, 7]。另外,細胞凋亡的細胞內的內切酶(Endonuclease)也會因胞內的鈣離子濃度上升而被活化,致使細胞的染色質(Chromatin)濃縮和斷裂成寡核體長度的片段(Oligonucleosome length fragments),其長度約為180~200 bp[7, 8];而這個現象,最早是由三個研究團隊在1976年和1981年發現的,他們利用放射線分別去照射老鼠的淋巴組織、胸腺和胸腺細胞,然後利用電泳的方式去看這些組織、細胞的染色質(Chromatin)的變化,結果都發現在膠(Gel)上有典型且類似梯子一樣的物質(Pattern)出現,也發現這些物質是長度不一的核體(Nucleosome)片段。稍後,在1984年時,A. H. Wyllie將這樣的發現和細胞凋亡連接起來[1]。而在細胞膜和細胞核則會有大水泡 (Blebbing)的現象[4],而有些研究者認為這樣的現象應稱為出芽(Budding),因為大水泡的現象是缺血性細胞死亡典型特徵,其為充滿液體且沒有包裹任何胞器的泡狀物,且通常會有腫脹和破裂的傾向;而出芽的現象,是指在此泡狀物裡有任何型式的胞器和核碎片,且水泡沒有腫脹的傾向。另外,水泡形成(Zeiosis) 8也是形容細胞有泡狀物產生現象的另一個詞,最早是因為發現在培養神經組織時,在沿著樹突的周圍有泡狀物的存在,但這樣的現象和大水泡的情況比較類似;因此,出芽是形容凋亡細胞的水泡狀物的最佳代名詞。
細胞凋亡所造成的細胞壞死,其主要的特徵有:和細胞分裂共同扮演起調節細胞存活的角色;在形態上,細胞呈現皺縮且會變得緻密,染色質濃縮而形成彎曲的外形,像是半月形(Half-moon)、馬蹄鐵(Horse-shoe)、鐮刀(Sickle)、柳葉刀(Lancet)、船型(Ship-like or Navicular)的形狀,細胞核碎裂,包裹核碎片的凋亡小體形成,凋亡小體被巨噬細胞或鄰近的細胞吞噬;細胞內的粒線體和其他胞器,沒有腫脹或不易察覺的腫脹產生;DNA會被切成以核體長度大小為基準的大小不一的片段;是藉由基因來控制的;整個過程是很快速的。
經由細胞凋亡所產生的細胞壞死,並不太會引發發炎反應的產生,因為凋亡的細胞通常在組織裡都是極少數的,在進行時,凋亡細胞會和其周圍的細胞脫離且皺縮,因此,就算有發炎物質的產生,其影響也不大,況且通常這些細胞都很快地被周圍的細胞吞噬掉。但在胚胎發育上,通常在個體形成過程中,往往會有大量的凋亡細胞產生,致使吞噬細胞聚集,而引發發炎反應,因此,這樣的現象被Saunders的研究團隊稱為猝變性細胞壞死(Cataclysmic necrosis)。
另外,細胞程序性死亡(Programmed cell death)近年來常被認為是細胞凋亡的另一個名稱,有人認為細胞凋亡與程序化細胞死亡(Programmed cell death)同一概念,但也有部份學者持不同觀點,他們認為並非所有細胞內基因控制的細胞死亡方式都是細胞凋亡,細胞凋亡只是程序化細胞死亡的方式之一。而這兩者確實有不一樣的地方,因為細胞程序性死亡就像一顆定時炸彈,要細胞何時死亡,細胞就必須依其規定進行;細胞凋亡就不像細胞程序性死亡一樣,往往經由外物所引起的,而非已排定好的行程。簡單的說,細胞程序性死亡就像是在精子與卵子相結合時,就已排定的細胞死亡行程,而細胞凋亡則是細胞遇到外物所產生的非計劃性程序化死亡方式,雖然說這兩者的死亡進行機制都是藉由基因來調控的。
細胞壞死/細胞凋亡共存 (Necrosis/Apoptosis coexist)
目前有關細胞死亡的專有名詞,除了細胞壞死和細胞凋亡較為大家所熟知之外。近年來也有些有關細胞死亡的專有名詞被創造出來,分別為Necrapoptosis[9]和Aponecrosis[10]。首先於1998 年中研院吳金洌研究員等人提出一個現象,他利用感染性胰臟壞死病毒感染魚細胞時發現,在同一個細胞內細胞凋亡特徵的表達在細胞壞死特徵的表達之前,而他將這樣的現象稱為“先凋亡後壞死(Apoptosis precedes necrosis)” [18]。之後於1999年北卡羅來納大學(University of North Carolina)的John J. Lemasters等人提出“Necrapoptosis” 這個名詞。“Necrapoptosis”在John J. Lemasters等人的定義下,是指細胞死亡一開始是經由細胞壞死和細胞凋亡共同的路徑去致死細胞,至於要走向那一種方式的死亡終點,完全取決於其他的因素。例如以粒線體滲透性轉換孔洞(Mitochondrial permeability transition pore)和細胞死亡的關係來作說明。在肝細胞裡,粒線體滲透性轉換孔洞對於由腫瘤壞死因子α (Tumor necrosis factor α)所引起的細胞死亡反應,扮演著重要的角色,而至於肝細胞會走向那一種死亡方式,完全是藉由細胞內ATP量的多寡所決定;若在粒線體滲透性轉換通道被破壞後,細胞內的ATP量下降,則細胞會走向細胞壞死路徑,反之,細胞內的ATP若上升或維持一定程度的量時,細胞則會走向細胞凋亡的路徑[11]。而這樣的現象是可以被理解的,因為在細胞凋亡是一種主動過程(Active process),細胞壞死是一種被動過程(Passive process)[12, 13];主動與被是取決於能量的消耗與否,在細胞中,ATP為主要的能量提供者。
在細胞凋亡的過程中,有些訊息傳導路徑會牽涉到粒線體;當粒線體被破壞時,則ATP無法被有效地合成出來給細胞運用,且一些物質也無法被組成和釋放,致使細胞走向細胞壞死的路徑[14, 15];因此,有人就認為粒線體是控制細胞凋亡形成與否的主要關鍵點[16, 17]。
在2000年,義大利佛羅倫斯大學的L. Formigli等人發表一篇文章,他們發現利用100 μM或200μM的Antimycin A處理老鼠的纖維母細胞,發現大多的細胞是走向細胞凋亡;若用250μM~1000μM的Antimycin A處理細胞,則大多數的細胞走向細胞壞死。另外,他們也發現,用100 μM或200μM的Antimycin A處理細胞,細胞內的ATP含量約為正常細胞的30%,而用大於300μM的Antimycin A處理細胞,細胞內ATP含量約為正常細胞的20%。因此,他們為這樣的現象創造出一個專有名詞“Aponecrosis” ,代表依作用物質濃度不同而改變凋亡細胞與壞死細胞比例的情形。我們認為基本上Necrapoptosis和Aponecrosis這兩個名詞所描述的現象非常一致,而不同之處在於所涵蓋的時間點略有差異。Necrapoptosis指細胞死亡一開始至最後細胞壞死或細胞凋亡結束為止,包括開始的經由細胞壞死和細胞凋亡的共同路徑去致死細胞的階段。而Aponecrosis則著重於細胞壞死和細胞凋亡的共同路徑之後,依作用物質濃度不同而影響細胞內的ATP含量,進而改變凋亡細胞與壞死細胞比例的情形。而且也可能因為在不同情況下凋亡細胞與壞死細胞比例所表現出的差異,使得檢測結果呈現細胞壞死或細胞凋亡。如果這樣的情況反應出真正的細胞死亡的方式與機制,那麼或許我們不應該把一羣細胞的死亡簡化成細胞壞死或細胞凋亡的二選一問題,而是類似二者競選的得票數高低問題。
綜合上述所介紹的各種關於細胞死亡的形式與過程的說明,為了釐清不同看法與見解的差異,我們試著以圖二來涵蓋上述的各部份,作一整理。
研究細胞凋亡的方法與檢測
目前在檢測凋亡細胞的方法主要有形態學上的研究、DNA降解的分析、DNA末端標記技術、流式細胞儀分析和核酸內切酶活性分析。
形態學的研究
由於細胞凋亡的過程在形態學上有一些特徵:細胞萎縮、細胞質濃縮、染色質凝聚並黏附在核膜形成隆起和出現凋亡小體;細胞內的粒線體、高爾基體沒有腫脹現象;在相當長一段時間內,核膜保持完整。這些細胞形態上的改變均可利用電子顯微鏡的技術來觀察。
將數位影像技術與電子顯微鏡相結合,可定量分析灰階改變,從而測出細胞核密度的細微變化;利用相位差顯微鏡可觀察到細胞膜出芽與凋亡小體;共軛焦掃瞄顯微鏡對形態分析及大分子定位具有優勢;使用穿透式和掃瞄式電子顯微鏡則可觀察到凋亡細胞核的形態、結構變化例如染色質皺縮、凋亡小體的形成和凋亡細膜出芽等現象。
也可利用各種染色法來觀察到細胞凋亡細胞的各種形態學特徵。有些染料例如臺盼藍(Trypan blue)為活細胞所排斥,但可使死細胞著色。DAPI(4,6-diamino-2-phenylindole)是常用的一種與DNA結合的螢光染料。借助DAPI的染色,可觀察到細胞核的形態變化。Giemsa染色法可以觀察到染色質皺縮、皺邊、凋亡小體形成等形態。利用碘化丙啶(Propidium iodide, PI)對細胞或細胞核染色後,即可測出濃縮的染色質及細胞核片段。有時也利用兩種染料進行複染,以便更可靠地確定細胞凋亡的變化。例如用吖啶橙(Acridine orange, AO)和溴化乙錠(Ethidium bromide, EtBr)進行複染,AO只進入活細胞,正常的細胞核及處於凋亡早期的細胞核呈現綠色:EtBr只能進入死細胞,將死細胞及凋亡晚期細胞的細胞核染成橙紅色。
DNA降解的分析
細胞凋亡中最重要的生化改變是細胞核內DNA的斷裂,形成間隔180~200bp整數倍的階梯狀電泳條帶(DNA ladder)。利用這一特性,將凋亡細胞核萃取物進行瓊脂糖凝膠電泳,即可得到上述典型的改變。降解狀電泳條帶常被認為是細胞凋亡的可靠指標。正常組織DNA沒有此降解,電泳條帶表現為一個大分子片段。壞死細胞DNA斷裂的位點是隨機的[13],電泳後出現連續分布的彌散(Smear)條帶[6]。
也有人利用DNA缺口處的游離3-OH末端,以磷32標記的脫氧核苷酸,在Klenow聚合酶的作用下,進行標記,然後進行電泳和放射自顯影。這一技術的缺點是費時,耗費細胞量多,且無法在異質細胞群中區別凋亡細胞。
另外,也可利用慧星電泳法(Comet assay)來測定細胞凋亡的現象。慧星電泳法的原理是將單個細胞懸浮於洋菜凝膠中,經裂解處理後,再在電場中進行短時間的電泳,並用螢光染料染色,凋亡細胞中形成的DNA分解片段,在電場中移動速度較快,使細胞核呈現出一種慧星式的圖案,而正常的無DNA斷裂的核在泳動時保持圓球形,這是一種快速簡便的凋亡檢測法。
核酸內切酶活性分析
(一)免疫學方法(ELISA法)
由於細胞凋亡的發生,主要是內源性核酸內切酶被激活,這種鈣和鎂依賴性核酸酶在最容易進入的核小體間裂解開雙股DNA,產生單/低聚核小體片段,而核小體DNA由於與組蛋白H2A、H2B、H3和H4形成緊密複合物而不被核酸內切酶裂解。所以採用雙抗體夾心酶免疫法,應用小鼠抗DNA和抗組蛋白的單株抗體,與核小體片段形成夾心結構,可特異性檢測細胞溶解物中的單/低聚核小體。
(二)電泳分析
核酸內切酶特異性的作用於DNA核小體間的位點。例如糖皮質激素處理的胸腺細胞可出現細胞凋亡,將其細胞核蛋白質萃取後,與HeLa細胞的細胞核共同培養,然後萃取DNA進行瓊脂糖凝膠電泳,即可區分隨機的DNA降解與核小體間的斷裂。
DNA末端標記技術
由於核酸內切酶的作用,凋亡細胞DNA降解產生缺口和3-OH末端,所以在組織切片或固定細胞上選用標記的DNA探針進行原位標記。其中一種方法稱為原位缺口轉譯(In situ nick translation),另一種方法為末端核苷酸轉移酶介導的dUTP末端標記(Terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-nediated dUTP nick end labeling, TUNEL)。以上方法中,DNA片段的3-OH末端可在DNA聚合酶或TdT作用下,用生物素(Biotin)、地高幸(Digoxin)、放射性核素(Radionuclide)或螢光素(Fluorescein)連接的dUTP進行標記,生物素和地高辛標記可通過組織化學法顯示,放射性核素用放射自動顯影,螢光素可在螢光顯微鏡下觀察,也可以流式細胞儀測定。TUNEL技術的敏感性更高。DNA末端標記技術的優點是:(1)能夠在組織切片上辨別形態學早期難以辨別的凋亡細胞;(2)與流式細胞儀(Flow cytometry)分析結合,可定量測定凋亡細胞的百分比;(3)與免疫螢光染色結合,可辨別不同細胞的凋亡情況。
流式細胞儀分析
流式細胞儀可從以下途徑反映凋亡細胞的特性:
(1)DNA含量:由於DNA分子被降解,DNA特異性螢光染色減少。
(2)細胞膜的完整性:凋亡細胞的細胞膜始終保持完整,在細胞膜通透性處理前不被碘化丙啶染色,壞死細胞則被染色;細胞膜通透性處理後再染色時,凋亡細胞的螢光強度低於正常細胞。因此,運用不同的核酸染色可區分凋亡細胞、壞死細胞和正常細胞。
(3)粒線體與溶酶體:凋亡細胞的粒線體跨膜電位仍然存在,因此可滯留染料Rhodamine 123。凋亡細胞保持了ATP依賴性溶酶體質子幫浦活性,仍能大量攝取吖啶橙。
(4)蛋白質:凋亡細胞中蛋白酶激活後,蛋白質含量減少,因而以Sulforhodamine 101(SR 101)染總蛋白,凋亡細胞較正常細胞少,而壞死細胞僅微量。
(5)凋亡細胞:凋亡細胞前向散射減少,側向散射不變或升高。
利用流式細胞儀來檢測凋亡細胞特性的方法有:
(一)亞G1峰的檢測法
處於增殖周期的細胞,根據其所處不同周期時期(G0/G1、S和G2/M),其DNA含量分布在2n~4n之間。發生細胞凋亡的細胞由於細胞核內DNA裂解成許多小片段,在酒精固定後,用細胞膜通透劑使小分子量的DNA片段穿過細胞膜而丟失,僅剩下大片段DNA這些失去部分DNA含量的細胞,在DNA染色後,形成一個DNA含量小於2n(即小於G1時期細胞)的分布區,稱為亞G1峰。
在經誘導後產生凋亡的細胞,在其DNA含量的組方圖(Histogram)上,在G1峰前會出現一個呈高斯分布的峰,即為亞G1峰,從分析峰的百分比即可得出凋亡細胞的百分比。而在正常細胞或會自發性產生細胞凋亡的細胞,其亞G1峰的百分比不會超過5%。另外,發生壞死的細胞或機械性損傷的細胞在G1峰前不會呈現高斯分布的亞G1峰,但可出現一個連續的DNA小片段分布曲線,以此就可和細胞凋亡區分開來。
(二)末端轉移酶標記技術
凋亡細胞是由於內源性核酸內切酶的激活,細胞核DNA被切割成許多雙股DNA片段以及高分子量DNA斷裂點(缺口),暴露出大量3’-OH末端,如果用帶有綠色螢光(FITC)的末端轉移酶和帶有紅色螢光(PI)來將細胞染色,這種帶有雙重螢光訊號的細胞經流式細胞儀分析後,則可顯示出不同細胞周期時期的細胞凋亡情況。
在利用此測定方法和經流式細胞儀分析後,凋亡細胞的表現為可被PI和FITC同時染色,而未進行細胞凋亡的細胞僅會被PI染上螢光,因此可利用這樣方式將凋亡的細胞和非凋亡的細胞區分開。
附註:
Oncosis leads to necrosis with karyolysis and stands in contrast to apoptosis, which leads to necrosis with karyorhexis and cell shrinkage.
2就是創造出“Chromatin”和“Mitosis”名詞的Walther Flemming。
3 The part vanishes, so that we can no longer perceive it in its previous form. We have no necrosed fragment at the end of the process.
4 Necrobiosis is death brought on by (altered) life – a spontaneous wearing out of living part – the destruction and annihilation consequent upon life – nature as opposed to violent death (mortification).
5“Pyknosis”這個名詞約在1890年被Edwin Klebs提出。
6“Karyorhexis”和“Karyolysis”這兩個名詞約在1879被Edwin Klebs提出。“Karyorhexis” 才是正確的寫法,“Karyorrhexis”則是錯誤的寫法。
7“Chromatolysis”這個詞是Walther Flemming依據在1885年觀察兔子的卵巢濾泡所察覺到細胞核的變化而提出的。一直到1914年才有足夠的研究資料顯示,Chromatolysis就是用來和mitosis維持平衡的機制,且一定存在所有的器官裡,這樣的理論是由德國的解剖學家Ludwig Gräper所提出。
8 “Zeiosis”是在1951年由Costero和Pomerat兩人所創造且提出的專有名詞;這個名詞是取自希臘字“zéiō”,其所帶表的意思為“沸騰時,水面上冒泡的樣子”。
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