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醫檢論壇 

抗SARS戰役中獨領風騷的分生檢驗技術

中國醫藥大學醫事技術學系、附設醫院檢驗醫學部 施木青

Abstract】【摘要】

中文摘要
前言:
今年的四、五兩個月,全台灣進入抗SARA的暴風陣內,人人自危,各醫院力求自保,醫檢同仁染煞陣亡,我們亦感悲痛,但發燒的病人卻沒有因此而下降,只要有人發燒、咳嗽,就會被當做疑似SARS的病人看待,連在醫院工作的我們都還會受到街坊鄰居的議論紛紛,人情冷暖箇中滋味,相信只要一談到SARS,大家均會有一籮筐的經驗可以討論。然而每天只要一打開新聞就會聽到衛生署疾病管制局發佈的通報疑似或可能SARS的個案數,其中有多少例是PCR(或稱RT-PCR)陽性,有多少例是陰性。SARS可能的案例需要PCR陽性來證實,發燒而被疑似SARS的個案也需要PCR陰性來排除。新聞每天炒得沸沸洋洋,大家應還記憶猶新。因此很多民眾,甚至醫療人員,除了關心口罩問題外,紛紛開始打探詢問甚麼是PCR(或RT-PCR)?哪裡可以做?怎麼做?我家的"外勞"發燒了,要不要做PCR?我從大陸回來可不可以做?要不要錢?等等很多的問題浮出檯面。
眾所皆知,長期以來檢驗工作在醫療制度下一直是幕後工作者,很少站出來說話(因為會干擾醫師的診斷),而此次SRAS的疫情,PCR(或RT-PCR)的檢驗方法卻一直於各類媒體報導中出現,雖然有被渲染誇大的嫌疑,應用PCR的技術來檢驗SARS病毒的有無是在眾多診斷SARS病人的各項參考依據中,被認為是客觀且直接的證據,因為它可快速偵測病毒的有無及多寡,作為判斷是否染煞的依據。衛生署疾病管制局在四月底以前承接了來自全國各醫療院所送驗的檢體,然而檢體越來越多到不勝負荷,才在五月中旬後要求台大、林口長庚、三總、台北榮總、中國附醫、高雄長庚、高醫和高雄榮總等幾家醫學中心設立SARS病毒檢驗方法,經能力測試證明後,將全國的待驗檢體依地區及各醫院承接意願分配,送往這幾家醫學中心速成的SARS病毒合約實驗室進行分生的檢驗程序,因此才緩解了疾管局的壓力。
SARS疫情至今對全國上下帶來的震憾與衝擊,對心靈與健康傷害不亞於九二一大地震,利用RT-PCR等分子生物方法來檢測SARS病毒的定性及定量的新技術也被震出檯面,受到各方的關切。以下內容針對SARS的檢驗技術進行一些先趨介紹,在此拋磚引玉,下一期的「醫檢會報」之特別報導將會以SARS為主題進行更廣面更深度的討論,敬請拭目以待。
一﹑甚麼是RT-PCR 和Real Time PCR?
RT-PCR和Real Time PCR 其實是兩種分子生物技術的檢驗方法。RT-PCR的全名是Reverse Transcriptase PCR (反轉錄酶PCR),其技術原理簡單的來說是將一段待測的RNA序列經反轉錄酶的作用轉錄成cDNA,再利用PCR技術將基因片段以幾何級數倍增的方式增加到數十萬倍,所形成的PCR基因產物經一種叫Ethidium bromide的化學物質作用,利用其會與DNA嵌合,經紫外燈照射時會發出肉眼可見的螢光,即在電泳膠片上會呈現具有特定分子量的PCR基因片段的產物。
而Real Time PCR中文翻譯為〝即時定量PCR〞。 它可做一般的DNA的PCR,亦可進行RT-PCR。一般來說,RT-PCR 是很傳統的分生技術,而Real Time PCR 則較為先進,二者應用的原理大致是相同的,(Real Time PCR 的原理在醫檢會報2002年vol.17.No2第40頁有詳細介紹,在此不再贅述)但其中最大的差異則是RT-PCR是在反應全部完成後,另外在電泳膠片呈現結果,而Real Time PCR 則是PCR反應一面進行時,機器就利用螢光偵測技術與電腦分析並記錄PCR的反應結果,所以當反應完成時,檢驗結果也就立即呈現。由於SARS病毒是一種RNA病毒,需利用RT-PCR的方法才能驗得出來,而Real Time PCR可做DNA和RNA的PCR,所以亦可以用來檢測檢體中RNA病毒的有無,甚至還可定量病毒量的多寡(Copies/ml)
二﹑如何檢驗SARS病毒?
如何診斷SARS和如何檢驗SARS冠狀病毒(Corona virus)雖是兩回事,但卻是密不可分,前者是臨床醫師對發燒、乾咳的病人診斷是否為重症急性呼吸道症候群(Severe Acute Respiratory Syndrome)屬於臨床判定。而SARS病毒的檢驗則是利用RT-PCR、Real Time PCR或是病毒培養技術,從病人的痰液、糞便或鼻咽、喉頭拭子驗出是否有SARS病毒的存在,前者需靠有經驗的醫師從病人的症狀和胸部X-光變化及一般性的檢驗結果來綜合研判,後者則同樣需要有經驗的檢驗人員從檢驗過程和檢驗結果來判斷是否有SARS病毒的存在,醫師的經驗和病人的症狀常會有個人主觀的認知差異或症狀不明顯的困擾,而檢驗結果則是客觀的科學證據,兩者是相輔相成的。這次SARS戰役中,由於面對被感染者的生命安全和病毒擴散的防疫問題,當事人(醫師、病人、家屬、衛生主管機構)都要求快速而正確的診斷,但只靠醫師就病人症狀和胸部X-光片的變化來判斷,發生模擬二可或意見不一致的情形時有耳聞,因此SARS病毒的檢驗結果就成為最有力的依據。
檢測SARS的方法目前來說可約略分為病毒培養、分生檢驗及血清學檢查。但SARS病毒的培養,除了需要特別的細胞株(Vero E6 cell line)才能養活這株冠狀病毒,在技術層面上較為困難,耗費時間約二星期或更長,而且有病毒感染及擴散的危險,須於生物安全P3級的實驗室內操作,並有良好的安全防護的情況下,才能確保工作人員及環境的安全,所以全台只有台大醫院病毒組高全良教授和少數幾個研究單位有設備、有能力來從事此項研究性工作。而其他的實驗室大都是利用RT-PCR和Real Time PCR的方法來檢驗SARS冠狀病毒的基因片段。
SARS的分生檢驗方法可分為三個步驟,第一是先從病人的檢體(痰液、糞便、鼻咽喉頭拭子)中萃取SARS冠狀病毒的RNA,第二步是將萃取出來的RNA利用反轉錄酶的作用將RNA轉成cDNA,再以PCR技術放大基因產物,第三步是偵測結果,傳統RT-PCR利用螢光染色和膠片電泳法呈現結果,Real Time PCR 則是利用儀器偵測螢光記錄反應結果。依據世界衛生組織的規定,要判定SARS病毒檢驗為陽性必須符合下列任一條件:
1. 兩種方法(指RT-PCR和Real Time PCR)都呈現陽性結果。
2. 至少兩種不同的檢體(痰、糞便…)同時呈現陽性結果。
3. 連續兩次的檢體(可同一種檢體)都呈現陽性結果。
4. 同一檢體兩個以上機構的檢驗結果都是陽性。
本院的SARS合約實驗室依據上述規定做檢驗結果的判定,尚稱順利,但不可諱言的是有時也會遇到RT-PCR結果陽性,但Real Time RT-PCR結果陰性,或是相反情形的情況,如遇此有疑異情形,重做是唯一的方法,或送疾管總局進行確認,直到有明確的檢驗結果才可發出報告。
不論用RT-PCR或Real Time PCR檢驗,就上機所需時間至少要花費三小時,而萃取病毒RNA的時間亦需二小時左右,再加上前後準備的時間,如穿脫完整的安全防護設備,檢體核對與編號等步驟,每進行一批檢體就至少需要六小時以上,以上時間的估算是以實驗進展最順利的情況來拿捏的,如遇「trouble」時,檢驗所需的時間又得延長,不過依疾管局規定,各合約實驗室核發SARS分生檢驗報告時效為二十四小時之內,各合約實驗室均會善盡職責。話說回來,有些商業廣告不實的媒體報導宣稱只要二或三小時就可驗出SARS病毒,請大家要仔細判斷!如果就現行各合約實驗室的作業模式,如不包含萃取病毒RNA的時間,且只有單一支的檢體時才有可能達到如此夢幻的時間。請大家試想,只要送SARS分生檢驗的病人哪一位不是VIP,不是病人病危就是要隔離,不是有火化的問題就是有醫療糾紛的情形,快速發出正確的檢驗結果是需要結合完善的作業流程,因此根據我們的經驗,實驗室採取批次作業而不是單獨處理,流程的安排是最有效率的,檢驗時間亦是最快的。當然,如遇緊急或特殊情形時,我們亦會有所拿捏,不會一成不變。
三﹑醫檢師在SARS戰役中的角色與任務
SARS病毒是一種前所未見的病毒,相關的檢驗方法的建立,相信大家也都沒經驗,自從美國國家疾病管制中心(CDC)將SARS病毒基因序列(RNA sequence)解碼之後,RT-PCR的方法即如雨後春筍般的出現。以本部的經驗來說,我們於SARS在台灣延燒的初期,為了要協助本院病人的診斷,在與台北疾管局聯絡及利用世界衛生組織(WHO)網站所公佈的RT-PCR引子序列(Primer sequence),立刻自行合成引子(Primer)並嘗試最佳的PCR反應條件,進行檢驗結果與臨床證據相互引證與比對的評估。而Real Time PCR的部分,試藥則是由衛生署疾管局直接提供引子(Primer)和探針(Probe),實驗室自行依儀器特性設計反應條件,其實這些檢驗方法都不會很困難,相信很多實驗室亦有相當的能力可以執行,但如果因為莫名的害怕或惶恐而裹足不前,只是袖手旁觀,喪失服務病人、服務社會的時機,身為醫檢師的我們就只能處於第二線,在這場戰役中誰是英雄不就了然於胸了嗎?
我們非常明瞭SARS病毒的危險,有句話不是這麼說的嗎?「最大的恐懼是來自於無知」,所以主動去認識SARS,吸收有建設性的資訊,相信SARS的危險是可控制與防護的。然而在實驗室內,規劃一套完整但是要可執行的安全防護措施是必要的,所有疑似SARS的檢體,我們都有相關的防護步驟要遵守,只要人人落實防護規定,在實驗室內因操作檢驗流程被SARS感染的機率是很低的。經此SARS風暴,我個人認為以分子生物技術為基礎的檢驗方法將會是未來醫檢界的主流,是醫檢界要努力開發的天地,然在各類生物技術的學系相繼成立的情況來看,醫檢師如何佔有優勢?如果仍固守傳統檢驗的地盤,將遲早成為醫療體制中少數的少數。所以我期許醫檢師的同仁們,隨者時代的改變,更要勇於嚐試,主動積極,把握機會,才能在新興疾病或未來的診斷工具佔有一席之地。
關鍵詞:

Abstract

Key words:

 

BacK

 

 
 
 
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